探索生物钟的奥秘-昼夜蛋白质组学分析揭示代谢途径转录后调控新机制
景杰生物/报道
编者按：生物体经历日夜循环进化出昼夜节律生物钟，使适当的细胞生理学活动发生在有利的时机，从而调节从睡眠到细胞代谢的一切活动。从真菌到动物，生物钟的调节机制是非常保守的，其核心是转录翻译的正负反馈环。而最近的研究证据表明存在昼夜节律调节的其它机制，包括由CSP-1组成的辅助回路对生物钟核心潜在的代谢反馈调节。此外，之前的昼夜节律蛋白质组学检测发现节律性蛋白质没有相对应的节律性mRNAs，这些都充分表明表达的mRNAs与翻译蛋白的不一致性。因此，只追踪昼夜节律中mRNA水平的变化来揭示细胞内昼夜节律生物钟对细胞功能的调控是片面且不可行的，我们还必须直接检测蛋白质水平的变化。
2018年12月26号，美国伦斯勒理工学院的Jennifer M. Hurley与达特茅斯盖塞尔医学院Jay C. Dunlap共同通讯在Cell Systems杂志发表题为“Circadian Proteomic Analysis Uncovers Mechanisms of Post-Transcriptional Regulation in Metabolic Pathways”的研究论文。作者利用脉孢菌作为模式生物，对其进行长时间、深度采样，利用TMT-MS方法研究其昼夜节律的蛋白质组。结果表明节律性mRNA和蛋白的相关性仅为60%，再次突出了此过程中广泛的转录后调控作用。
本研究数据还突出显示了广泛存在的蛋白质水平上对代谢途径的昼夜节律调控作用。最后，研究发现转录因子CSP-1在这种代谢调控中起作用，尤其是对脂质，脂肪酸和核苷酸能量代谢通路的调节。因此，能量利用和翻译调节可能是昼夜节律蛋白质组学更重要的决定因素。
1. 脉孢菌昼夜节律蛋白质组学分析
研究者利用TMT-MS技术于48 h内，每2 h对脉孢菌的相关蛋白质水平进行定量检测。共鉴定到52251个肽段，在70%以上的样本中检测到4742蛋白质（占脉孢菌蛋白质组的45%）。eJTK_cycle分析发现，其中27%的蛋白（约1273个蛋白）具有昼夜节律性。
作者分析了节律蛋白的峰相随昼夜节律的动态变化（图1B-C）,发现节律蛋白表达的高峰期出现在主观下午和晚上（CT7-CT21），并高度集中在“黄昏”时分（CT12–CT14）。功能注释分析表明，节律蛋白主要发挥参与代谢和调节代谢的功能（图1D-E）。
图1. 节律蛋白主要是代谢功能相关主要峰值出现在主观黄昏后
2. 野生脉孢菌昼夜节律转录组和蛋白质组的对比研究
作者用同样的分析方法，发现40%的转录组（3,858个转录本）是有明显的节律性的，大概2/3 (2,414/3,858)的节律性基因与TMT-MS检测到的蛋白相对应（图2A），其中752个基因（约占总节律蛋白质59%）在转录和蛋白质水平呈现明显的节律性。而对于这部分转录和蛋白质水平的节律性的基因，其转录和蛋白水平峰值相位的延迟范围从0小时（77个或10%的基因）到22小时不等，平均相位延迟约10.3小时（图2B）。
为了观察这些不同组基因的整体相位分布（仅mRNA水平具有节律性、mRNA和蛋白质水平兼具节律性及仅蛋白质具节律性），作者利用时钟式密度图形象的描述了显著节律性mRNA和/或蛋白质的峰相（图2C）。
3. 广泛存在的蛋白质水平上对代谢途径的昼夜节律调控
作者使用了Biocyc通路基因组数据库（BioCyc Pathway Genome Database，PGDB）中通路工具软件，对参与或调解代谢的节律蛋白表达水平的进行观察， 并计算出一天当中每个Biocyc途径中节律性转录本或蛋白质平均水平，最终发现，许多代谢途径中总节律mRNA峰值时相与总节律蛋白峰值时相平均值并不一致 （图3）。
此外，当具体观察蛋白质组时，参与能量代谢途径（如发酵及有氧呼吸）的蛋白质也在昼夜节律“黄昏”附近出现峰值，但参与戊糖磷酸途径的节律蛋白则相反（图3A）。除能量代谢之外，一些参与分解代谢和合成代谢途径的节律蛋白达到峰值的实现是彼此相反的（图3B-C）。
4. CSP-1参与代谢蛋白质昼夜节律性调节
为了探讨CSP-1对代谢蛋白质组的调节作用，作者构建了csp-1敲除菌株（Δcsp-1）。TMT-MS定量分析突变株蛋白组，共检测到4742个蛋白质，其中1316种为昼夜节律性蛋白质，对这些节律蛋白进行功能富集分析发现，与野生型菌种蛋白质组不同，Δcsp-1菌株中节律性蛋白质组中没有富集到与代谢相关的（图4A）。
接下来，作者分别分析了WT菌株或Δcsp-1菌株特有的显著性节律蛋白质（图4B）。WT株和DCSP-1株的时钟式密度图表明，Δcsp-1菌株节律蛋白的主要峰值时相位于CT0/CT24处（图4D），与之前预测csp-1作为早晨转录抑制因子的功能结论一致。然而，节律蛋白的峰值相位柱状图说明，WT以及DCSP-1菌株之间节律蛋白峰值相位具有明显差异（图4E）。
图4. CSP-1参与代谢蛋白的昼夜节律的调节
综上所述，Hurley等人通过对脉孢菌进行深度采样，利用先进的生物信息学工具，对昼夜节律的转录组以及蛋白质组进行研究。分析发现，昼夜节律存在广泛的转录后调控机制，尤其是对代谢途径的调控，再次强调了昼夜节律中翻译水平调控的重要作用。
参考文献：
Hurley JM, et al. (2018), Circadian Proteomic Analysis Uncovers Mechanisms of Post-Transcriptional Regulation in Metabolic Pathways. Cell Systems.
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